Hur man gör spektrofotometrisk analys: 13 steg (med bilder)

Spektrofotometri är en experimentell teknik som används för att mäta koncentrationen av lösningar i en specifik lösning genom att beräkna mängden ljus som absorberas av de lösta. Denna teknik är kraftfull eftersom vissa föreningar kommer att absorbera olika våglängder av ljus vid olika intensiteter. Genom att analysera det ljus som passerar genom lösningen kan du identifiera speciella upplösta ämnen i lösning och hur koncentrerade dessa ämnen är. En spektrofotometer är den enhet som används för att analysera lösningar i en laboratorieforskningsinställning.

Steg

Del 1 av 3:

Förbereder proven

1. Slå på spektrofotometern. De flesta spektrofotometrar måste värma upp innan de kan ge en exakt läsning. Slå på maskinen och låt den sitta i minst 15 minuter innan du kör några prover.

Använd uppvärmningstiden för att förbereda dina prover.

Bild med titeln Gör spektrofotometrisk analys Steg 2

2. Rengör kyvetterna eller provrören. Om du gör ett laboratorium för skolan kan du använda engångsprovrör som inte behöver rengöras. Om du använder kyvetter eller återanvändbara provrör, se till att de är ordentligt rengjorda före användning. Skölj varje kyvett noggrant med avjoniserat vatten.

Var försiktig med kyvetter eftersom de kan vara ganska dyra, särskilt om de är gjorda av glas eller kvarts. Quartz kyvetter är konstruerade för användning i UV-synlig spektrofotometri.

Vid hantering av kyvetten, undvik att röra på sidorna, kommer ljuset att passera genom (i allmänhet de klara sidorna av behållaren). Om du av misstag rör på dessa sidor, torka kyvetten med en Kimwipe (som är formulerade för att förhindra att glaset).

Bild med titeln gör spektrofotometrisk analys Steg 3

3. Ladda den korrekta volymen av provet i kyvetten. Vissa kyvetter har en maximal volym av 1 milliliter (ml) medan provrör kan ha en maximal volym av 5 ml. Så länge som lasern som producerar ljuset passerar genom vätskan och inte en tom del av behållaren får du en noggrann läsning.

Om du använder en pipett för att ladda dina prover, använd ett nytt tips för varje prov för att förhindra korskontaminering.

Bild med titeln Gör spektrofotometrisk analys Steg 4

4. Förbered en kontrolllösning. Känd som ett ämne har kontrolllösningen endast det kemiska lösningsmedlet, i vilket det lösliga att analyseras löses i. Till exempel, om du hade salt upplöst i vatten, skulle ditt tomt bara vara vatten. Om du färgar det röda vattnet måste ämnet också innehålla rött vatten. Ämnet är samma volym som lösningen som ska analyseras och hållas i samma typ av behållare.

Bild med titeln gör spektrofotometrisk analys Steg 5

5. Torka utsidan av kyvetten. Innan du placerar kyvetten i spektrofotometern vill du se till att det är så ren som möjligt för att undvika störningar från smuts eller dammpartiklar. Med en luddfri trasa, ta bort eventuella vattendroppar eller damm som kan vara på utsidan av kyvetten.

Del 2 av 3:

Köra experimentet

1. Välj och sätt in ljusets våglängd för att analysera provet med. Använd en enda våglängd av ljus (monokromatisk färg) för att göra testningen mer effektiv. Färgen på det valda ljuset bör vara en känd för att absorberas av en av de kemikalier som tros vara i testlösningen. Ställ in önskad våglängd enligt specifikationerna för din spektrofotometer.

I ett klassrumslaboratorium kommer våglängden sannolikt att ges till dig.
Eftersom provet kommer att återspegla allt ljus av samma färg som det verkar, kommer den experimentella våglängden alltid att vara en annan färg än det för provet.
Objekt visas som vissa färger eftersom de speglar ljus av speciella våglängder och absorberar alla andra färger. Gräs är grönt eftersom den klorofyll i den speglar grönt ljus och absorberar allt annat.

Bild med titeln gör spektrofotometrisk analys Steg 7

2. Kalibrera maskinen med ämnet. Placera ämnet i kyvetthållaren och stäng av locket. På en analog spektrofotometer kommer det att finnas en skärm med en nål som rör sig baserat på intensiteten av ljusdetektering. När ämnet är i bör du se nålen flytta till höger. Spela in detta värde om du behöver det för senare. Med det tomma som fortfarande finns i maskinen, flytta nålen till noll med hjälp av justeringsknappen.

Digitala spektrofotometrar kan kalibreras på samma sätt, de kommer bara att ha en digital avläsning. Ställ in blanket till 0 med hjälp av justeringsknapparna.

När du tar bort det tomma, kommer kalibreringen fortfarande på plats. Vid mätning av resten av dina prover kommer absorbansen från ämnet automatiskt att subtraheras.

Var noga med att använda ett enda tomt per session så att varje prov är kalibrerat till samma tomma. Om du till exempel blek spektrofotometern, analysera bara några av prover och blanka det igen, de återstående proven är felaktiga. Du skulle behöva börja om.

Bild med titeln gör spektrofotometrisk analys Steg 8

3. Ta bort tomt och testa kalibreringen. Med det tomma som tagits bort bör nålen stanna vid 0 (noll) eller den digitala avläsningen ska fortsätta att läsa 0. Placera tomten tillbaka i maskinen och se till att nålen eller avläsningen inte ändras. Om maskinen är korrekt kalibrerad med ditt tomt ska allt bo på 0.

Om nålen eller avläsningen inte är 0, upprepa kalibreringsstegen med ämnet.

Om du fortsätter att ha problem, sök hjälp eller ha maskinen tittat på för underhåll.

Bild med titeln Gör spektrofotometrisk analys Steg 9

4. Mäta absorbansen av ditt experimentella prov. Ta bort ämnet och placera det experimentella provet i maskinen. Skjut kyvetten i det angivna spåret och se till att den står upprätt. Vänta ca 10 sekunder tills nålen är stabil eller tills de digitala siffrorna slutar ändra. Registrera värdena på% transmittans och / eller absorbans.

Absorbansen är också känd som den optiska densiteten (OD).

Ju mer ljus som sänds, desto mindre lyser provet absorberar. Generellt vill du registrera absorbansvärdena som vanligtvis ges som ett decimaltal, till exempel 0.43.

Om du får ett avlägset resultat (t.ex. 0.900 när resten är runt 0.400), späd provet och mäta absorbansen igen.

Upprepa läsningen för varje enskilt prov minst 3 gånger och genomsnittet tillsammans. Detta garanterar en mer exakt avläsning.

Bild med titeln Gör spektrofotometrisk analys Steg 10

5. Upprepa testet med successiva våglängder av ljus. Ditt prov kan ha flera okända föreningar som varierar i sin absorbans beroende på våglängd. För att eliminera osäkerhet, upprepa dina läsningar med 25 nm intervaller över spektret. Detta gör att du kan upptäcka andra kemikalier som misstänks vara i lösningen.

Del 3 av 3:

Analysera absorbansdata

1. Beräkna provets transmittans och absorbans. Transmittans är hur mycket av det ljus som passerade genom provet nått spektrofotometern. Absorbans är hur mycket av ljuset har absorberats av en av kemikalierna i lösningen. Många moderna spektrofotometrar har en produktion av transmittans och absorbans, men om du spelade in intensitet kan du beräkna dessa värden.

Transmittansen (T) finns genom att dividera ljusets intensitet som passerade genom provlösningen med den mängd som passerade genom ämnet. Det uttrycks normalt som ett decimaltal eller procent. T = I / I₀ där jag är intensiteten i provet och jag₀ är intensiteten av ämnet.
Absorbansen (A) uttrycks som det negativa av bas-10-logaritmen (exponent) av transmittansvärdet: a = -log₁₀T. För ett T-värde på 0.1, värdet av A är 1 (0.1 är 10 till -1-effekten), vilket betyder att 10% av ljuset sänds och 90% absorberas. För ett T-värde på 0.01, värdet av A är 2 (0.01 är 10 till -2-effekten), vilket betyder att 1% av ljuset sänds.

Bild med titeln Gör spektrofotometrisk analys Steg 12

2. Plotta absorbansvärdena mot våglängderna på ett diagram. Absorbansvärdet är plottat på den vertikala Y-axeln mot våglängden av ljus som används för ett givet test som är plottat på den horisontella X-axeln. Plottar de maximala absorbansvärdena för varje våglängd av ljusstest, producerar provets absorbansspektrum och identifierar föreningarna som utgör testämnet och deras proportioner.

Ett absorbansspektrum har vanligtvis toppar vid vissa våglängder som kan låta dig identifiera specifika föreningar.

Bild med titeln Gör spektrofotometrisk analys Steg 13

3. Jämför ditt absorbansspektrumplot till kända tomter av specifika föreningar. Föreningar har unikt absorbansspektrum och kommer alltid att producera en topp med samma våglängd varje gång de mäts. Genom att jämföra dina tomter av okända föreningar till de kända föreningarna kan du identifiera de lösta ämnena som komponerar din lösning.

Du kan också använda den här metoden för att identifiera föroreningar i ditt prov. Om du förväntar dig en klar topp vid en viss våglängd och du får 2 toppar på separata våglängder, vet du att något inte är rätt i ditt prov.